Пцр для диагностики иппп: какие инфекции выявляет анализ на зппп?

Исследование мазка методом ДНК-диагностики (ПЦР)

Исследование мазка ДНК-методом (ПЦР) основывается на анализе ДНК непосредственно самого возбудителя, находящегося в забранном материале. К числу методов ДНК-диагностики относится исследование ПЦР (полимерная цепная реакция), диагностика соскобов из уретры, шейки матки, влагалища. ПЦР-диагностика является очень действенной при выявлении вирусов, бактерий, простейших, грибков, для диагностики вялотекущих инфекций. С помощью ПЦР выявляются хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, вирус папилломы человека, признаки генитального герпеса и так далее. Материалом для исследования служит соскоб эпителиального слоя шейки матки, соскоб из цервикального канала или из зоны трансформации для выявления дисплазий и подобных заболеваний.

Забор материала производится следующим образом: слизь из выбранной области удаляется ватным тампоном. Затем одноразовой стерильной щеткой производят забор материала, делая два оборота в левую и правую стороны. Для выявления возбудителей требуется сделать соскоб эпителия, поскольку именно в этой структуре содержится внутриклеточный паразит. Далее забранный материал вместе со щеткой аккуратно выводят из влагалища, погружают в специализированный контейнер с физиологическим раствором и отправляют либо в лабораторию, либо, при необходимости ожидания, в холодильную камеру для хранения. Храниться материал может до двух суток при температурном режиме до +8 градусов.

Поскольку процедура взятия и исследования мазка методом ПЦР довольно сложна, она требует соблюдения ряда правил, в частности, соблюдение полной стерильности, точное выполнение алгоритма взятия материала, соблюдение правил проведения исследования и транспортировки материала в лабораторию. Хранение образцов также должно производиться в строгом соответствии с правилами. Основным объектом исследования служит вирус папилломы человека (ВПЧ)

Важность своевременной диагностики ВПЧ заключается в том, что он является мощным возбудителем заболеваний онкологического характера, дисплазий, кондилом и так далее. Рак шейки матки в большинстве случаев вызван именно вирусом папилломы человека.

Все вышеперечисленные лабораторные исследования являются наиболее распространенными в гинекологии. Кроме них, специалистом могут быть назначены и другие методы диагностического исследования. Подробную информацию о каждом из них, адресные данные и контакты клиник города Москвы, а также прочую справочную информацию вы можете узнать на нашем ресурсе.

Принцип действия

Необходимые компоненты

Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК с помощью ферментов in vitro (в искусственных условиях). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

С помощью ПЦР обычно могут быть амплифицированные относительно короткие (до 10 kbp) участки ДНК с известными концами, в отдельных случаях могут использоваться участки в 40kbp. Для проведения простейшей ПЦР нужны следующие компоненты:

• ДНК-матрица, то есть фрагмент ДНК, содержащий ту область, которую нужно амплифицировать.
• Два праймеры, комплементарные концам необходимого фрагмента.
• Термостабильная ДНК-полимераза.
• Дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T).
• Буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивает периодическую и быструю смену температуры (охлаждение и нагрев) тестовых пробирок с раствором, обычно с точностью не менее 0,1 ° C.

Праймеры

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами (короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18-30 оснований). Каждый из праймеров комплементарный одной из цепей двухцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец участка, амплифицируемого.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления _(T m) комплекса праймер-матрица. Она определяется, как температура, при которой половина нуклеотидов праймера гибридизована с матрицей. _T m можно примерно определить по формуле, где _n X — количество нуклеотидов Х в праймеры. Если праймер короткий и _T m мала, то праймер может оказаться частично комплементарным к другим участкам матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления — оптимум действия полимеразы, активность которой обычно падает при температуре выше 80 ° C. Поэтому тщательный дизайн праймеров — необходимая задача, которую следует провести перед тем, как начинать ПЦР.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

• содержание GC ~ 40-60%;
• близкие _T m праймеров (отличия не более, чем на 5 ° C);
• отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек и димеров;
• желательно, чтобы на 3 ‘конце был гуанин или цитозин.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий (см рисунок 2):

1. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94-96 ° C (или до 98 ° C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5-10 мин., Чтобы цепи ДНК разделились. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров.
2. Когда цепи разошлись, температуру снижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом (англ. Annealing). Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4-5 ° С ниже их температуру плавления. Время стадии — 0,5-2 мин.
3. ДНК-полимераза реплицирует матричный цепочку, используя праймер как затравку. Это так называемая стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Полимеразы Taq и Pfu, часто используемые активные за 72 ° C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины фрагмента амплифицируют. Средняя скорость элонгации — 1000 пар оснований в 1 мин. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечной фрагменты. Эта стадия длится 10-15 мин.

КАК работает ПЦР

В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, с помощью ПЦР можно амплифицировать относительно короткие участки ДНК, длиной не более 3000 пар оснований. Используя смеси различных полимераз, специальных катализаторов и соблюдая особые условия, исследователям удавалось амплифицировать с помощью ПЦР фрагменты ДНК длиной 20-40 тыс. пар оснований. Но это все равно ничтожно мало в сравнении с длиной хромосомной ДНК эукариотической клетки. Геном человека, например, состоит примерно из 3 млрд. пар оснований.

Для того, что бы провести анализ методом ПЦР, необходимо иметь в наличии короткие одноцепочечные участки ДНК, специфичные для данного вида возбудителя, называемые «праймерами».

Но специфичного участка длиной в несколько тысяч оснований вполне достаточно, что бы дифференцировать тип возбудителя.

Для проведения ПЦР вначале исследуемый материал нагревают до температуры денатурации, добиваясь того, что бы двухцепочечные молекулы ДНК исходного материала разделились на одиночные нити. Затем вносят праймеры. При внесении праймеров в раствор с исследуемым материалом, праймеры начинают «прочесывать» раствор в поисках участков, к которым они являются комплиментарными. Если такие участки найдены – то праймеры присоединяются к ним, образовав стартовые двухниточные участки.

После присоединения праймера (этот процесс называют «отжиг») начинается синтез маркированного специфического участка ДНК с помощью специфического фермента – Taq-полимеразы, который получают из термофильных бактерий. Вновь синтезированные фрагменты ДНК становятся матрицами для синтеза новых участков ДНК в последующих циклах амплификации. Поэтому такая реакция и называется цепной. В результате 25 циклов амплификации из одного участка ДНК синтезируется 106 копий. А после 30-40 циклов нарабатывается достаточное количество ДНК, что бы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.

ПЦР при беременности

Мазок на ИППП методом ПЦР показан женщинам при беременности для выявления хронических, скрыто протекающих инфекций. Во время беременности хронические инфекционные заболевания обостряются и могут вызвать внутриутробное инфицирование плода. Наиболее опасны герпетическая и цитомегаловирусная инфекции.

Герпес

Генитальный герпес часто обостряется при беременности и проявляется специфическими высыпаниями на коже и слизистых. В большинстве случаев обострение ограничивается внешними проявлениями, не несет угрозы для плода. Лечение проводится противовирусными мазями.

У женщин с ослабленным иммунитетом, хроническими болезнями вирус герпеса распространяется на матку, происходит внутриутробное поражение плода. Определить, насколько глубоко распространился вирус, помогает ПЦР. При наружном поражении ПЦР будет отрицательным. Вирус обнаруживается в мазке, только если он попал в шейку матки. Лечение проводят противовирусными препаратами для приема внутрь.

Цитомегаловирус

Цитомегаловирус относится к группе герпесвирусов. Человек заражается им в детстве, подростковом возрасте. В дальнейшем наблюдается пожизненное носительство цитомегаловируса, которое не вредит здоровью. Лечения такое состояние не требует.

У беременных женщин с ослабленным иммунитетом может произойти реактивация вируса. Иногда женщины заражаются цитомегаловирусом впервые во время беременности. Эти ситуации чреваты внутриутробным поражением плода. Для выявления цитомегаловируса нужно сдать ПЦР. Если мазок дает положительный результат, показано лечение противовирусными препаратами. ПЦР — вид диагностики герпеса, цитомегаловируса, хламидий и других ИППП. Преимущество методики — выявление генетического материала возбудителей. Ложноположительных результатов не бывает, вероятность ложноотрицательных очень низкая. Для исследования берут соскоб слизи из уретры, влагалища, шейки матки.

Достоинства и недостатки

К лаборатории, осуществляющей ПЦР-диагностику, предъявляются высочайшие требования в плане оборудования, тест-систем и квалификации медицинского персонала. Это высокотехнологичная лаборатория, располагающая арсеналом высокочувствительных и высокоспецифичных реагентов, поэтому особых недостатков она не имеет. Разве что выдает положительный результат при отсутствии клинических проявлений и тем самым ставит лечебника перед дилеммой: стоит начинать лечение или нет?

Врач, наблюдающий пациента, начинает сомневаться в достоверности результатов тестирования, поскольку никаких признаков заболевания не видит. Но все же, учитывая высокую чувствительность ПЦР-системы, следует помнить, что она обнаруживает возбудителя даже в доклинической стадии, а положительный результат в таком случае является скорее достоинством, чем недостатком

Исходя из этого, лечащий врач должен сам принять решение о целесообразности терапии, взяв во внимание и другие аргументы «за» и «против»

Преимущества диагностики с помощью полимеразной цепной реакции очевидны:

• Высокая специфичность, достигающая 100%, обусловленная присутствием в отобранном образце частиц нуклеиновых кислот, присущих конкретному организму, но чужеродных человеку;
• Высокая производительность, ведь ПЦР – высокотехнологичная автоматизированная методика, предоставляющая возможность проведения тестирования в день забора материала и избавления, таким образом, пациента от лишних треволнений;
• ПЦР, работая над одной пробой, способна провести несколько исследований и обнаружить несколько возбудителей, если ей будет такое задание. Например, при диагностике хламидийной инфекции, где ПЦР относится к основным методам, наряду с хламидией, можно обнаружить и нейссерию (гонококк) – возбудитель гонореи. Причем, на достоверности результатов это негативно не отражается;
• Тестирование методом ПЦР выявляет опасные микроорганизмы в инкубационном периоде, когда они еще не успели нанести ощутимый вред организму, то есть, ранняя диагностика предупреждает о грядущем развитии патологического процесса, что дает возможность подготовиться к нему и принять во всеоружии.

Кроме этого, во избежание недоразумений, иной раз возникающих при диагностике, ПЦР защищает себя еще и тем, что ее результаты могут  зафиксироваться (фотография, компьютер) с целью использования их в экспертных целях, если будет на то необходимость.

Нормой в ответах ПЦР считают отрицательный результат, указывающий на отсутствие фрагментов чужеродных нуклеиновых кислот, положительный ответ будет свидетельствовать о наличии инфекции в организме, цифровые значения означают состояние вируса и его концентрацию на момент тестирования. Однако полную расшифровку анализа осуществляет врач, прошедший специальную учебу по теме «ПЦР». Пытаться же интерпретировать результаты самостоятельно не имеет никакого смысла, поскольку можно, что скорее всего и произойдет, неправильно понять и начать заранее волноваться.

Что такое полимеразная цепная реакция

Основа анализа — амплификация (удвоение) – создание множества копий из короткого участка ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), представляющей генетический комплекс человека. Для исследования нужно очень малое количество физиологического вещества (мокрота, каловые массы, соскоб эпителия, сок простаты, кровь, сперма, околоплодные воды, слизь, ткань плаценты, моча, слюна, жидкость плевральная, цереброспинальная). При этом, например, в мочеполовом тракте больного возможно обнаружение даже единичного вредоносного микроба.

Методику ПЦР (полимеразной цепной реакции) разработал американский ученый К. Мюллисом, в 1993 получивший Нобелевскую премию.

Активно используется:

• в раннем диагностировании инфекций, генетических, онкологических патологий;
• в судебно-медицинской экспертизе при наличии для исследования крайне малого количества ДНК;
• в ветеринарной медицине, фармацевтике, биологии, молекулярной генетике;
• для идентификации личности по ДНК, подтверждения отцовства;
• в палеонтологии, антропологии, экологии (при отслеживании качества продуктов, факторов внешней среды).

Анализ методом ПЦР

ПЦР анализ — что это такое? Это метод использует принципы молекулярной биологии. Для исследования материала применяются особые ферменты, которые многократно и быстро копируют ДНК, РНК фрагменты возбудителей болезни. Существует разные виды ПЦР анализа в зависимости от исследуемого материала (кровь, моча, кал и т.д.). После обработки сотрудники лаборатории сравнивают с базой данных полученный результат, выявляют концентрацию, тип возбудителя.

Анализ на ПЦР помещают в специальный амплификатор (прибор), который нагревает и охлаждает пробирки с биоматериалом. Изменения температуры нужны для репликации фрагментов. Точность результата будет зависеть от точности температурного режима. Метод полимеразной цепной реакции помогает выявить:

• инфекционный мононуклеоз;
• ВИЧ;
• цитомегаловирусную инфекцию;
• вирусные гепатиты G, C, B, A;
• инфекции/заболевания, передающиеся половым путем (ИППП/ЗППП): гарднереллез, трихомониаз, уреаплазмоз;
• герпетическую инфекцию;
• онкогенные вирусы;
• листериоз;
• хеликобактерную инфекцию;
• клещевой энцефалит, боррелиоз;
• туберкулез;
• кандидоз.

Крови

На данный момент из-за новизны технологии анализ крови методом ПЦР все еще имеет высокую цену. Для подготовки биоматериала не нужно соблюдать определенные требования. Даже вызванные физическими нагрузками, стрессами, сменой рациона питания изменения состава не влияют на результат исследования. ПЦР анализ крови может испортить только прием антибактериальных средств, поэтому перед сдачей необходимо выдержать паузу между лечением и тестом.

ПЦР исследование крови – самый распространенный вариант диагностики хронических, острых инфекционных патологий при вирусном или атипичном проявлении. Серологические методы исследования имеют определенную трудность при проведении – определение наличия возбудителя проводится по наличию антител в организме человека. Результат мог быть ложноотрицательным, если состояние больного не давало время для их выработки.

Мазка

В сфере гинекологии для исследования наличия инфекционных микроорганизмов используют ПЦР анализ мазка. Работа с материалом проводится по тому же принципу, что и с кровью: многократное увеличение фрагментов ДНК возбудителя, чтобы с легкостью его идентифицировать. Это же помогает обнаружить скрытые инфекции у женщины. Для проведения анализа могут быть взяты разные биологические жидкости: слюна, мокрота, моча, кровь. В гинекологии для точности определения чаще используется мазок со слизистой влагалища из цервикального канала.

Для проведения ПЦР существуют определенные показания. Нередко его нужно сделать, чтобы выявить устойчивый к антибиотикам вид возбудителя. У женщин основными показаниями для диагностики по этому методу выступают:

• беременность, которая протекает тяжело;
• острая фаза ИППП;
• если есть подозрение на переход ИППП в хроническую стадию;
• поиск причин бесплодия.

Кала­

Для выявления инфекции может быть назначен со стороны врача анализ кала на ПЦР. Для того, чтобы получить максимально достоверные результаты после теста, необходимо придерживаться следующих правил перед забором биоматериала:

• за несколько суток прекратить прием слабительных препаратов: масла, свечи;
• исключить медикаменты, которые дают специфическую окраску калу, к примеру, с содержанием железа.

Для забора следует использовать стерильную палочку и контейнер. Чем-либо их дополнительно протирать, ополаскивать не нужно. При сборе материала будьте осторожны, вы не должны задеть рукой внутренние стенки контейнера. Следите, чтобы в кале не было примесей мочи, нельзя использовать дополнительные вспомогательные средства для испражнения (клизма). Собирать материал нужно в день сдачи, хватит 1/3 объема контейнера. Данный метод диагностики имеет следующие преимущества:

1. Анализ способен указывать на ДНК паразита, другие же тесты могут определять только остатки их жизнедеятельности.
2. Высокая точность, будет установлен возбудитель.
3. Ультрачувствительный анализ, который способен выявить даже одну клетку вируса.
4. Результат исследования ПЦР будет готов через 4-5 часов.

Мочи

При необходимости для проведения теста врач может взять для исследования мочу. Высокая точность открывает возможность работать с любой биологической жидкостью, из которой удается извлечь ДНК вируса. Чтобы сдать анализ мочи ПЦР, нужно придерживаться таких ограничений перед забором материала:

• минимум за 1 день до процедуры прекратить половые контакты;
• за 3 недели до сдачи должно быть окончено любое антибактериальное лечение, потому что медикаменты смажут картину;
• сдавать анализ нужно натощак (жидкость тоже запрещена);
• брать нужно первую утреннюю порцию материала.

Диагностика методом ПЦР – выявление и диагностирование

Метод ПЦР – это такое исследование, которое выявляет фактически весь спектр возбудителей вирусного и бактериального характера. Полимеразная реакция, как диагностика заболеваний у мужчин, женщин и детей, показывает результаты исследований в различных областях медицины: гинекологии, урологии, терапии и так далее.

В частности, при сдаче крови идентифицируют такие заболевания:

• гепатиты вирусного характера: А, В, С и D, ТТ – сдается кровь;
• цитомегаловирус;
• ВИЧ;
• вирусы герпеса (обнаруживаются не только у мужчин и женщин, но и у детей соскоб показывает результат);
• опоясывающий лишай;
• инфекция энтеровирусная;
• токсоплазмоз;
• краснуху;
• коклюш;
• листериоз (сдается соскоб тканей лимфоузлов, кровь, околоплодные воды и т.д.) и прочее.

Стоит отметить, что цитомегаловирус является бессимптомным заболеванием. То есть человек со здоровой иммунной системой может носить в организме цитомегаловирус без знания проблемы заболевания. Цитомегаловирус наделен 60-тидневным инкубационным периодом. Запущенная форма болезни опасна для мужчин, при беременности, и порождает, как цепная реакция, энцефалит, пневмонию и прочие заболевания.

Методика ПЦР выявляет коклюш – острое инфекционное заболевание дыхательных путей (верхних), опасное так же при беременности, для детей и мужчин. Коклюш передается воздушно-капельным путем. Фактически 90% людей при контакте с больным, должны сдать анализ на коклюш, поскольку инфекция отличается повышенной контагиозностью.

При беременности коклюш может вызвать асфиксию плода. У мужчин, детей, женщин при беременности коклюш в запущенном виде поражает, как цепная реакция, сердечно сосудистую систему, легкие, бронхи. Чтобы обнаружить коклюш для исследования у мужчин, женщин и деток, берется соскоб либо мазок полости рта, кровь из вены/пальца, мокрота и моча.

Кроме крови ПЦР исследует иного рода биоматериалы: фрагменты мочи, соскоб, мазки, слюну у мужчин, детей, женщин и обязательно при беременности околоплодные воды по назначению врача, ведь стоимость исследования не мала. Частные лаборатории устанавливают собственную стоимость на производимые анализы.

Диагностика типового плана крайне важна, поэтому стоимость играет меньшую роль в определении заболевания. При получении ложноотрицательных результатов с лаборатории расшифровка их уже не важна, а болезнь может быть не идентифицирована и запущена цепная реакция инфецирования всего организма.

Средняя стоимость

Цены на проведение полимеразной цепной реакции определяют: вид исследования, сложность идентификации возбудителя, трудность забора биологического материала, вид анализа (качественный или количественный), уровень цен в лаборатории.

Ориентировочно, стоимость анализа ПЦР в рублях:

• гонококк, гарднерелла, трихомонада вагиналис – от 180
• хламидия трахоматис – от 190
• папилломавирус – от 380 до 500
• биоценоз урогенитального тракта у женщин (количественная и качественная оценка микрофлоры) – от 800.

2.4 Эффект «плато»

Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым эффектом «плато».

Термин эффект “плато” используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации.

В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения эффекта “плато” влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента), количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы, конкуренция за реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами, концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.

Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на “плато». Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.

Преимущества и недостатки

За широкий перечень преимуществ автор методики получил Нобелевскую премию, как подтверждение признания специалистов универсальности и высоких возможностей такого способа диагностики.

К неоспоримым достоинствам ПЦР можно отнести следующие:

• Очень высокая чувствительность. Обычно говорят о чувствительности от 95 до 100%, но это усредненные данные. Этот показатель отличается для разных микроорганизмов. Так, для гепатита С он не бывает ниже 97% (при условии выполнения всех требований), а для определения уреаплазмоза — не менее 99%. Такая чувствительность является самой высокой на данный момент, поэтому способ почти не имеет конкурентов по этой характеристике.
• Возможность применения на самых ранних стадиях. В то время, когда другие методы диагностики еще не способны выявить возбудителя из-за его малого количества в образце пробы, ПЦР уже выдает корректный результат. Обнаружить присутствие возбудителя можно даже при наличии единственного экземпляра, а в некоторых случаях — только фрагмента микроба. По этой причине способ применяется и при хронических или скрытых течениях патологий, а также в стадии инкубации.
• Широкий спектр результатов. Анализ способен выявить одновременно несколько возбудителей, для этого не понадобится проводить повторные манипуляции. Иногда удается найти возбудителей, которые даже не предполагались при первичной диагностике.
• Универсальность образцов. В качестве пробы могут быть представлены образцы крови, слюны, мокроты, волосы, выделения из влагалища, клетки разных тканей.
• Скорость получения результатов. В большинстве случаев ответ получают через 5-6 часов. Для культурального анализа, приближающегося к полимеразной цепной реакции в плане точности, такой же результат можно получить в срок от нескольких дней до пары недель.
• Количественное определение возбудителя. Этот параметр позволяет определять титр микробов в материале, а это свойство часто необходимо для оценки эффективности выбранной тактики лечения.
• Выявление самого микроорганизма, а не определение его реакций. Большинство анализов основаны на ответной реакции возбудителя на химические реактивы, окрашивание и т. д. Этот способ диагностики позволяет обнаруживать непосредственно микроб, а не косвенные признаки, антитела и т. п.

Несмотря на такой широкий перечень преимуществ, у метода есть и некоторые недостатки:

• Из-за загрязнения пробы предыдущим образцом может произойти ложное выявление микроорганизмов. Такое происходит при загрязнении инструментов или реактивов, участвующих в ходе анализа. Даже в воздухе присутствуют фрагменты микробов, способных отразится на результате, поэтому в таких лабораториях обязательно должен быть установлен биологический фильтр с максимальной степенью очистки воздуха.
• Ложноотрицательный результат. Даже при всех явных проявлениях болезни иногда получают отрицательные данные. Причина этого – в неверно выбранном месте для взятия образца, поэтому персонал лаборатории должен обладать достаточной квалификацией, знаниями и опытом.
• Оценка данных должна производиться исключительно лечащим врачом, потому что интерпретация результатов ПЦР-анализа — сложный процесс. Наличие положительного ответа не всегда означает болезнь. Дело в том, что после того, как заболевание успешно пролечено, фрагменты возбудителя долго присутствуют в крови, поэтому заключение может сделать только очень квалифицированный специалист.
• Высокая стоимость диагностики с применением полимеразной цепной реакции. Цена обусловлена дорогостоящим оборудованием и высокими требованиями к условиям лабораторий и квалификации персонала.

Обязательные условия для получения точных данных в ПЦР-лабораториях:

• корректный механизм забора проб и их правильная транспортировка в лабораторию;
• точное соблюдение методик в ходе выполнения анализа;
• высокая стерильность и максимальная автоматизация процесса;
• использование одноразовых инструментов;
• система внутрилабораторного контроля для подтверждения достоверности данных.

При условии выдерживания всех требований на основе данных, полученных при помощи методики ПЦР, можно не только определить болезнь, но сделать прогноз ее течения и составить алгоритм лечения.

Как и когда пациенты узнают о результатах?

В среднем на получение ответа при исследовании по методу ПЦР отводится от нескольких часов до двух дней. При любом результате пациента извещает медицинское учреждение, направившее его на анализ.

В случае положительного ответа принимается решение о помещении его на домашний карантин или на лечение в стационар в зависимости от тяжести протекания заболевания. Обязательно устанавливается круг лиц, с кем в ближайшее время заболевший контактировал. У них производится забор материала для проведения теста на коронавирус.

В случае отрицательного результата рекомендуется повторить тест через 4 дня от первого забора материала на анализ. Не исключается вероятность, что заражение произошло, но диагностика проведена слишком рано.

Российские тест-системы по методу ПЦР

Отечественные лаборатории активно включились в процесс разработки тестов на определение коронавирусной инфекции.

Узнать подробнее, где сдать тест на коронавирус и антитела к нему, а также о его стоимости, можете ознакомиться на этой странице.

2.2 Циклический температурный режим

Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов.

1. Денатурация.
На первом этапе необходимо денатурировать ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95° С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. Этот процесс длится не менее 1 минуты.

2. Отжиг.
На втором этапе температуру смеси понижают до 55°С праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры выбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.

Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа.

После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК, начиная с 3’-конца праймера.

3. Элонгация (синтез).
На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы — 75°С, и начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3’-гидроксильной группой праймера, с максимальной эффективностью.

Иногда, в случае близкого значения температуры отжига праймеров к температуре оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухстадийный цикл ПЦР, совместив две стадии — отжиг и элонгацию — в одной.

В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.

Фактически значение эффективности отдельных циклов амплификации составляет, по некоторым данным, 78-97%. В случае присутствия в пробе ингибиторов реакции это значение может быть намного меньше.

Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляется автоматически. Каждый цикл обычно длится 3 — 5 минут.

Первый цикл. ДНК-мишень фланкирована определенными последовательностями. К образцу ДНК добавляют праймеры (Р1 и Р2), ДНК-полимеразу Tag и четыре дНТФ. Здесь каждая из новосинтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3’-гидроксильной группы «её» праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Такие цепи называют «длинными матрецами», именно на них будет идти дальнейший синтез. Эти цепи служат матрицами во втором раунде ПЦР.

Во втором цикле двухцепочечную ДНК, состоящую из исходной и новосинтезированной («длинная матрица») цепей, вновь денатурируют, а затем отжигают с праймерами. При отжиге праймеры гобридизуются с комплементарными им участками как исходных цепей, так и «длинных матриц», синтезированных в первом цикле. В результате ферментативного синтеза на исходных цепях синтезируются «длинные матрицы», а на «длинных матрицах» — «короткие», с праймером на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймер, на другом.

В третьем цикле все гетеродуплуксы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплецируются. При отжиге праймеры гибридизуются с комплементарными участками исходных цепей, а также «длинных» и «коротких» матриц. При ферментативном синтезе invitro на исходных цепях синтезируются «длинные матрицы», а на «длинных» и «коротких» матрицах — только «короткие матрицы».

В послудующих циклах число «коротких матриц» становится все больше.

Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.

3.4.1 Положительные контроли

В качестве «положительного контроля» используют препарат ДНК искомого микроорганизма. Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образуемых в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Размер неспецифических продуктов может быть как большего, так и меньшего размера по сравнению с положительным контролем. В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.

Для контроля специфичности образуемого продукта амплификации можно использовать гибридизационные зонды (участки ДНК, расположенные внутри амплифицируемой последовательности), меченные ферментными метками или радиоактивными изотопами и взаимодействующими с ДНК в соответствии с теми же принципами, что и праймеры. Это значительно усложняет и удлиняет анализ, а его стоимость существенно увеличивается.