Методы исследований в микробиологии

Введение понятие о микробах

Объектом изучения
микробиологии являются микроорганизмы
(микробы) — мельчайшие не­видимые
одноклеточные и многоклеточные существа,
которые по многообразию не уступают
представителям животного или растительного
царства.

Особенности
микробов:

• малые размеры
  (обычно их измеряют в микрометрах, 10-6
  м, мкм);

• слабая морфологическая
  дифференцировка (относительно простое
  строение);

• быстрый рост и
  размножение (в благоприятных условиях
  одна особь за сутки может дать потомство
  в сотни миллионов особей);

— высокая активность
обменных процессов (быстрый синтез и
разложение веществ,
получение энергии);

— повсеместное
распространение (связано с выраженной
способностью к адаптации).

Микробиология
является комплексом наук. В зависимости
от объекта исследования различа­ют:
бактериологию, вирусологию, микологию
(объект — грибы), протозоологию (объект
— простей­шие). По целям изучения
микробиология делится на общую,
медицинскую, санитарную, ветери­нарную,
промышленную, космическую и др.

Задачи медицинской
микробиологии:

1. Изучение
биологии патогенных (болезнетворных)
и нормальных для человека микробов.

2. Изучение
роли микробов в возникновении, развитии
инфекционных (заразных) болезней и
формировании иммунного ответа
макроорганизма («хозяина»).

3. Разработка
методов микробиологической диагностики
(распознавания), специфического
лечения
и профилактики (предупреждения)
инфекционных болезней человека.

Микробиологические
исследования проводятся в специальных
научных или практических лабораториях,
где поддерживается противоэпидемический
режим.
Соблюдение особых правил ра­боты в
лаборатории преследует 2 цели: а) исключить
возможность внутри лабораторного
заражения и выноса инфекции за пределы
лаборатории; б) предотвратить микробное
загрязнение воздуха, оборудования и
материалов, снижающее качество анализа.

КЛАССИФИКАЦИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ

Микробы, как наиболее
древняя форма жизни, в
системе
организмов представлены довольно
широко. Они входят (наряду с другими
организмами) в надцарство эукариотов,
полностью составляют надцарство
прокариотов и царство вирусов.

Прокариоты —
это, как правило, одноклеточные организмы,
бактерии, отличающиеся слабой
морфологической дифференцировкой
(доядерные); для них характерно:

• отсутствие
  окруженного мембраной ядра (носителем
  наследственности является нуклеоид —
  замкнутая в кольцо нить ДНК, единственная
  «бактериальная хромосома»);

• отсутствие органелл
  (митохондрий, хлоропластов, комплекса
  Гольджи и др.);

• размножение
  бинарным амитотическим делением
  (надвое);

• особое строение
  и состав клеточной стенки, малые размеры
  рибосом, своеобразные фермен­ты
  белкового синтеза.

Прокариоты разделены
на 35 групп: спирохеты, несколько групп
собственно бактерий (на­пример,
«грамположительные кокки»,
«спорообразующие грамположительные
палочки и кокки», «грамотрицательные
аэробные палочки и кокки» и др.), а
также риккетсии и хламидии, микобактерии,
микоплазмы. В основе деления прокариот
на группы лежат: форма и строение клетки,
отношение к окраске методом Грама, тип
метаболизма и другие признаки. Внутри
группы выделены более мелкие таксоны:
порядок, семейство, род, вид (основной
таксон). Название вида микроба, как
правило, состоит из родового и видового
названий. Например, один из возбудителей
дизентерии носит название- Shigella
sonnei.

Микроскопические
эукариоты —
это относительно более высоко
организованные однокле­точные и
многоклеточные организмы, имеющие
сходство с клетками животных (простейшие)
и растений (грибы). Для эукариот характерны:

наличие истинного
ядра, в котором находится набор линейных
хромосом, распределяющих­ся в ходе
митоза в дочерние клетки;

• различные органеллы
  (митохондрии, комплекс Гольджи,
  эндоплазматический ретикулум и др.);

• рибосомы большего
  размера, чем у прокариот;

• способность к
  эндоцитозу (захвату частиц и растворенных
  веществ).

Вирусы — это
мельчайшие неклеточные организмы,
которые можно противопоставить всем
другим существам. Основные свойства
вирусов:

отсутствие
клеточного строения;

отсутствие
собственных метаболических систем (у
вирусных частиц — вирионов нет обмена
с внешней средой);

облигатный
внутриклеточный паразитизм;

наследственный
материал (геном) представлен одним
типом нуклеиновой кислоты (ДНК или
РНК).

Объекты санитарно-микробиологического исследования в лпу. Методы отбора и исследования смывов на санитарно-показательные мо. Интерпретация результатов санитарно-микробиологических исследований

Контроль
стерильности материала и режима
стерилизации в автоклавах прово­дится
прямым и непрямым (косвенным) способами.
Прямой
способ — бактериологи­ческий;
посев с перевязочного материала и белья
или использование бактериологи­ческих
тестов. Для бактериологических тестов
используют пробирки с известной
спороносной непатогенной культурой
микроорганизмов, которые погибают при
определенной тем­пературе. Материалом
обя­зательно засевают две среды —
тиогликолевую (для роста бакте­рий)
и среду Сабуро (для роста грибов).
Отсутствие роста микробов свидетельствует
о сте­рильности материала.

Непрямые
способы контроля
— используют вещества с определенной
точкой плавления. Закладывают в биксы
при стерилизации.

Подсчет клеток на фиксированных мазках

Прямое микроскопическое изучение грунта осуществляется по методу микробиологического исследования, разработанному Виноградским. В определенном объеме приготовленной суспензии подсчитывается число клеток микроорганизмов. Изучение фиксированных мазков позволяет сохранять препараты в течение длительного срока и выполнять подсчеты в любое удобное время.

Приготовление препарата осуществляется следующим образом. Определенный объем суспензии (как правило, 0.02-0.05 мл) наносится с помощью микропипетки на предметное стекло. К нему добавляют каплю раствора агар-агара (смеси полисахаридов агаропектина и агарозы, извлеченных из бурых и красных водорослей Черного моря), быстро перемешивают и распределяют на площади 4-6 кв. см. Мазок высушивается на воздухе и фиксируется 20-30 мин. спиртом (96 %). Далее препарат увлажняют дистиллированной водой, помещают в р-р карболового эритрозина на 20-30 мин.

После окрашивания его промывают и высушивают на воздухе. Подсчет клеток осуществляется с иммерсионным объективом.

Значение биологического метода исследования

Анализ пробы бактерий имеет свое практическое применение. Прежде всего бактериологический метод исследования может использоваться в медицине. К примеру, необходимо изучить микрофлору больного, чтобы установить правильный диагноз, а также выработать правильный ход лечения. Здесь помогает антибиотикограмма, которая покажет активность лекарственных препаратов против возбудителя заболеваний.

Анализ бактерий используется в лаборатории для определения таких опасных заболеваний, как туберкулез, возвратный тиф или гонорея. Также он применяется для изучения бактериального состава миндалин, полостей органов.

Бактериологический метод исследования можно использовать для определения загрязненности среды. По данным о количественном и качественном составе мазка с поверхности какого-либо предмета определяется степень заселенности данной среды микроорганизмами.

Культуральный (бактериологический)
метод исследования — совокупность
способов, направленных на выделение и
идентификацию чистых культур
микроорганизмов (бактерий) с помощью
культивирования на питательных средах.

Чистая
культура — совокупность микроорганизмов
одного вида. Чаще всего чистую культуру
получают путем отбора и культивирования
изолированной колонии (потомство одной
микробной клетки).

Этапы метода:

1. Забор материала для исследования.

2. Выделение чистой культуры и ее
идентификация.

3. Заключение.

Забор материала для исследования.
Вид исследуемого материала зависит от
цели исследования (диагностика — от
больного; эпиданализ — из внешней среды,
продуктов питания, больного и (или)
бактерионосителя).

Выделение чистой культуры
. Включает
3 или 4 этапа:

1. Посев материала (после предварительной
микроскопии) на чашку с плотной питательной
средой (лучше дифференциально-диагностической
или селективной) с целью получения
изолированных колоний. Производят его
чаще всего методом механического
разобщения. В некоторых случаях (например,
кровь) материал предварительно засевают
в жидкую среду обогащения с последующим
пересевом на чашку с агаровой средой.
Иногда до посева проводят селективную
обработку материала (с учетом свойств
выделяемого микроорганизма; например,
обработка кислотой или щелочью для
выделения устойчивых бактерий).
Культивируют при температуре 37°С в
течение 18-24 часов. Время культивирования
для разных видов бактерий может
колебаться.

2(3):а) изучение колоний на чашке с агаром
(культуральные признаки), отбор наиболее
типичных; б) приготовление мазков из
этих колоний с окраской (по Граму или
другими методами); а) отсев остатка
исследованной колонии на среду
накопления и выращивание в термостате
при оптимальной температуре.

3(4). Изучение чистоты культуры, полученной
на среде накопления. С этой

целью готовят мазок, окрашивают (чаще
по Граму), микроскопически изучают

морфологическую и тинкториальную
однородность (в разных полях зрения).

4(5). Идентификация чистой культуры.

Заключение.
По совокупности
признаков в сравнении со свойствами
эталонных (типовых) штаммов указывается
вид выделенного из материала микроорганизма.

Оценка метода:

достоинства:
относительно высокая
чувствительность и точность, возможность
определить численность микробов в
исследуемом материале, а также
чувствительность к антибиотикам;недостатки:
относительная длительность,
метод дорогостоящий.

Как происходит взятие материала

Анализ сдается как минимум через 10 суток после окончания антибиотикотерапии. Перед забором материала нельзя мыть место его взятия гелем или мылом с антибактериальными компонентами.

Процедура зависит от материала, который берется на диагностику:

• Моча собирается утром после подмывания половых органов без использования антибактериального мыла. Образец собирается в чистую емкость в объеме примерно 10-15 мл и сразу доставляется в лабораторию. Образцы, взятые с клеенок и суден, не подходят из-за бактериальной загрязненности.
• Перед взятием мазков из половых путей нельзя спринцеваться, вводить свечи и гели. Материал не собирается во время критических дней.
• Образец на анализ кала берется утром специальной лопаткой в чистую посуду в объеме примерно 30 мг. Нельзя использовать кал, взятый у детей из подгузников, полученный с помощью клизм и слабительных средств.
• Мокроту собирают в специальную чашечку после чистки зубов и полоскания полости рта. Анализ из носоглотки и горла берется медперсоналом клиники.
• Грудное молоко собирают после мытья груди и обработки околососковой зоны спиртом. Первые капли сцеживаются, чтобы промыть молочные протоки, а затем собирается 15 мл в пробирку.
• Мазок из уретры у мужчин берется врачом-урологом. Перед этим в течение 5-6 часов желательно воздержаться от мочеиспускания, иначе урина смоет микробов, и результат будет неточным.

Санитарно-показательные микроорганизмы

Присутствие или отсутствие санитарно–показательных микроорганизмов указывает на загрязнение или стерильность объекта микробиологического исследования, который считается чистым, если в его составе или на его поверхности не обнаружено следующих микробов:

• кишечной палочки;
• гемолитических стрептококков;
• гемолитических стафилококков.

В процессе микробиологического контроля продуктов ведется учет вышеперечисленных патогенных организмов, однако их число в различных местах обитания существенно разнится. Связано это с тем, что патогенные микроорганизмы предпочитают обитать в среде, подверженной эпидемической вспышке. Поэтому возможное загрязнение выявляют с помощью индикаторных микроорганизмов, которые соответствуют следующим критериям:

• наличие общей среды обитания и метода распространения с патогенными микробами;
• высокая жизнеспособность в сравнении с патогенными микроорганизмами;
• простой способ определения.

В результате многолетних исследований в различных странах в качестве индикатора загрязнения воды, продуктов питания, оборудования и персонала используют бактерии группы кишечной палочки. Чистоту воздуха определяют с помощью таких индикаторных микроорганизмов, как гемолитические стафилококки. Для оценки загрязнения почвы применяют  грамположительные споровые палочки – Clostridium perfringens и Clostridium sporogenes.

Иногда выделить патогенные микроорганизмы становится сложно, что обусловлено рядом причин:

• доля патогенов во всей микрофлоре продуктов ничтожно мала (1/30000 часть);
• быстрая адаптация патологических организмов к условиям окружающей среды;
• патогены способны размножаться только на специальных культурах тканей и клеток.

Чтобы микробиологическое исследование продуктов было успешным и результативным, необходимо проводить его с использованием качественного и надежного оборудования, которое можно приобрести в нашей компании.

Какие бактерии выявляют?

Для каждого вида вод определяют нормативные показатели по содержанию микроорганизмов. Количество варьируется в большую или меньшую степень, но незначительно.

Определяемые патогенные микроорганизмы для микробиологического анализа отличаются для каждого источника.

Данные представлены в таблице:

Если степень загрязнения превышает эти данные, источник не пригоден для использования в любой области человеческой деятельности.

Приказ 535 «Об унификации микробиологических методов исследования»

Бактериологический анализ занимает важнейшее место в комплексе клинико-лабораторных мероприятий, направленных на диагностику, профилактику и лечение разнообразных инфекционных заболеваний. Однако исследованием окружающей среды они не ограничиваются.

Особое значение имеет бактериологический анализ биологического материала в лечебных учреждениях. К исследованиям, проводимым в медучреждениях, предъявляются повышенные требования. Целью Приказа «Об унификации микробиологических методов исследования» является совершенствование бактериологического анализа, повышение качества и эффективности микробиологической диагностики.

Воздух

Он считается транзитной средой для микроорганизмов. Основными методами микробиологического исследования воздуха являются седиментация (оседание) и аспирация.

Микрофлора воздушной среды условно разделяется на переменную и постоянную. К первой относятся дрожжи, пигментообразующие кокки, спороносные бациллы, палочки и прочие микроорганизмы, устойчивые к высыханию, воздействию света. Представители переменной микрофлоры, проникая в воздух из привычной для них среды обитания, недолго сохраняют свою жизнеспособность.

В воздухе крупных мегаполисов микроорганизмов намного больше, чем в воздушной среде сельской местности. Над морями, лесами бактерий очень мало. Очищению воздуха способствуют осадки: снег и дождь. В закрытых помещениях микробов намного больше, чем на открытых пространствах. Их количество повышается в зимний период при отсутствии регулярного проветривания.

Объекты санитарно-микробиологического исследования на стерильность. Методы отбора проб и их исследование. Интерпретация результатов санитарно-микробиологических исследований на стерильность

Про­бы отбирают
методом смыва стерильным ватным тампоном,
по­мещенным в пробирки с пептонной
водой. Перед взятием пробы тампо­ны
увлажняют. Для проведения смывов с рук
увлажненным ват­ным тампоном протирают
руки обследуемого. Перед исследованием
смывную жидкость с тампоном или салфеткой
встряхивают в течение 10 мин для десорбции
микроорганизмов и далее смывную жидкость
ис­пользуют для посевов.

Методика
исследования.Определение
БГКП.

Определение
Staphylococcusaureus.
1
мл смывной жидкости засе­вают в
пробирку солевого бульона, инкубируют.
При наличии роста высевают на желточно
– солевой агар для получения изолированных
колоний.

Требования
к микробиологической чистоте: присутствие
БГКП, синегнойной палочки, протеев,
стафилококка в смывах не
допус­кается.

Определение микробного числа

Этот метод санитарно микробиологического исследования воды состоит в следующем. В 1 мл воды определяют количество факультативных анаэробов и мезофильных (промежуточных) аэробов, способных на мясопептонном агаре (основной питательной среде) при 37 град. на протяжении суток формировать колонии, видимые при увеличении в 2-5 р. или невооруженным глазом.

Ключевой стадией рассматриваемого метода микробиологического исследования воды является посев. Из каждой пробы делается посев не менее 2-х разных объемов. При анализе водопроводной воды в каждую чашку вносят по 1-0.1 мл чистой жидкости и по 0.01-0.001 мл загрязненной. Для посева 0.1 мл или меньшего объема жидкость разводится дистиллированной (стерильной) водой. Последовательно готовят десятикратные разведения. По 1 мл от каждого из них вносят в две чашки Петри.

Разведения заливаются питательным агаром. Его необходимо предварительно растопить и остудить до 45 град. После активного перемешивания среду оставляют на горизонтальной поверхности для застывания. При 37 град. посевы выращивают на протяжении суток. Рассматриваемый метод микробиологического исследования воды позволяет учитывать результаты на тех чашках, где количество колоний находится в пределах от 30 до 300.

Методы и цели микробиологии

К методам исследования любых микроорганизмов относят:

• микроскопия: световая (в том числе фазово-контрастная, темнопольная, флуоресцентная) и электронная;
• культуральный метод (бактериологический, вирусологический);
• биологический метод (заражение лабораторных животных с воспроизведением инфекционного процесса на чувствительных моделях);
• молекулярно-генетический метод (ПЦР, ДНК- и РНК-зонды и др.);
• серологический метод — выявления антигенов микроорганизмов или антител к ним (ИФА).

Цель медицинской микробиологии — изучение структуры и свойств патогенных микробов, взаимоотношения их с организмом человека в определенных условиях природной и социальной среды, совершенствование методов микробиологической диагностики, разработка новых, более эффективных лечебных и профилактических препаратов, решение такой важной проблемы, как ликвидация и предупреждение инфекционных болезней

Бизнес и финансы

БанкиБогатство и благосостояниеКоррупция(Преступность)МаркетингМенеджментИнвестицииЦенные бумагиУправлениеОткрытые акционерные обществаПроектыДокументыЦенные бумаги — контрольЦенные бумаги — оценкиОблигацииДолгиВалютаНедвижимость(Аренда)ПрофессииРаботаТорговляУслугиФинансыСтрахованиеБюджетФинансовые услугиКредитыКомпанииГосударственные предприятияЭкономикаМакроэкономикаМикроэкономикаНалогиАудитМеталлургияНефтьСельское хозяйствоЭнергетикаАрхитектураИнтерьерПолы и перекрытияПроцесс строительстваСтроительные материалыТеплоизоляцияЭкстерьерОрганизация и управление производством

Современные методы бактериологического исследования

Все бактериологические исследования можно разделить на две группы в зависимости от того, каков предполагаемый результат.

I. Исследуемый объект должен быть стерилен.

В такой ситуации обнаружение любого микроорганизма является поводом для серьезного беспокойства. О чем идет речь? О крови, моче, материнском молоке, спинномозговой жидкости. Принципиально другой вопрос состоит в том, что взять для бактериологического исследования мочу или молоко и не нарушить при этом стерильности — очень сложно и практически невозможно в амбулаторных условиях. Неудивительно, что к положительным результатам, когда в моче или молоке обнаруживается некая бактерия, врачи часто относятся с определенной (весьма значительной) долей скепсиса. Никогда не бывает стопроцентной уверенности в том, что этот микроб действительно живет в молоке, а не попал туда с поверхности кожи, действительно живет в моче, а не на слизистой оболочке мочеиспускательного канала.

II. Для исследования берется заведомо нестерильный материал.

Всегда, когда изучается нечто, находящееся в контакте с окружающей средой, это нечто содержит бактерии. Любые мазки со слизистых оболочек, любые современные исследования слизи, мокроты, кала в обязательном порядке заканчиваются тем, что будет найдено определенное количество самых разнообразных микробов. Обнаруженные микробы по-разному взаимодействуют с человеческим организмом. Это позволяет выделить три группы бактерий:

1.

Бактерии нормальные, мирные, безвредные или даже полезные, являющиеся естественными обитателями исследуемой среды;

2.

Бактерии опасные, с большой долей вероятности способные вызвать болезнь — патогенные. Их обнаружение — тревожный сигнал, повод к углубленному обследованию, лечению;

3.

Бактерии условно-патогенные — бактерии, мирно сосуществующие с организмом человека, но потенциально опасные, способные вызвать болезнь при определенных обстоятельствах, которые в большинстве случаев возникают тогда, когда ослабевает иммунная защита организма ребенка.

Алгоритм бактериологического исследования

Узнать имя микроба — это далеко не все, хотя и очень важно. Ведь обнаружить некую бактерию — например, в мазке из носа золотистый стафилококк — вовсе не значит доказать, что именно он является причиной насморка: вполне возможно, что стафилококк живет себе мирно в носоглотке, а насморк вирусный или аллергический

Как же разобраться?

Во-первых, понимать, что любые бактериологические исследования — это дополнительная диагностика, а основная диагностика — это реальные жалобы и симптомы.

Во-вторых, следует знать, что современные культуральные методы бактериологической диагностики позволяют не только обнаружить микроб, но и определить, какое количество бактерий присутствует во взятом для исследования материале. В результате мы получим из лаборатории бланк бактериологического исследования, в котором увидим не только имя бактерии, но и ее концентрацию. Выглядит это примерно так: «Обнаружен S. aureus 106», что означает: обнаружен золотистый стафилококк в концентрации 106 микробных клеток на миллилитр (м.к./мл).

Выявив рост бактерий, можно ответить на вопрос, к каким антибактериальным средствам (антибиотикам) они (бактерии) чувствительны. Для этого в питательную среду добавляют различные современные препараты и оценивают, прекращается ли размножение микробов. Прекращается — значит, бактерия чувствительна к данному антибиотику, не прекращается — устойчива.

Санитарно-микробиологическое исследование мяса и мясных продуктов. Критерии микробиологической безопасности

При микроскопическом
исследовании мяса определяют коли­чество
бактерий в мазках-отпечатках, которые
готовят из кусоч­ков мяса. Мазки
окрашивают по Граму и микроскопируют.
Мясо считается свежим, если в поле зрения
обнаружено не более 10 бактериальных
клеток.

Бактериологическое
исследование мяс­ных продуктов:
определяют микробное число, а также
устанавливают присут­ствие БГКП,
сальмонелл, бактерий рода Proteus,
стафилококков и клостридий.

Для
определения общего
количества микроорганизмов
в 1 г продукта делают посев 0,1 и 0,01 г
продукта на питательный агар, инкубируют
48ч и подсчитывают число колоний.

Для определения
БГКП в 1 г продукта производят
посев 5 мл взвеси на элективно —
дифференциальную среду для БГКП и
содержит питательный. При росте
лактозоположительных БГКП синий цвет
меняется на темно-зеленый или
ярко-желтый.

Что делать после получения результата?

Если полученные данные благоприятные, не выявлено обильного роста микрофлоры, вода пригодна для использования.

Тестирование повторяют каждые полгода, чтобы следить за качеством воды, особенно если она питьевая. В воде может незначительно повышаться количество инфекционных агентов.

Если их число не превышает верхнюю границу нормы, воду кипятят или пропускают через собственную систему очистки, после чего употребляют. Это снижает вероятность заражения:

1. человека,
2. почвы,
3. животных.

При значительном превышении уровня патогенной флоры обращаются в коммунальные службы, если исследовалась питьевая вода из-под крана.

Можно подать жалобу в санэпидстанцию, которая предпримет меры для улучшения фильтрационной системы. Если это колодезная вода, человек должен решить проблему самостоятельно (поставить фильтры).

Показания к проведению посевов на флору и чувствительность к антибиотикам

• Любые урогенитальные патологии, в том числе ЗППП. Этот метод диагностики особенно рекомендуется при инфекциях, трудно поддающихся лечению.
• Проблемы с кишечником. Анализ высевает все основные кишечные группы и позволяет подобрать не только антибиотики, но и пробиотики.
• Любые гнойные поражения – язвы, раны, лактационный мастит. С помощью посева можно понять, какие микробы вызывали нагноение, и подобрать антибиотик.
• Беременность – в этот период делаются посевы из носоглотки, чтобы выявить микрофлору, опасную для будущего малыша.
• ЛОР-инфекции и поражение дыхательных путей. Проведение бакпосева рекомендуется при затяжных ринитах, фарингитах, частых ангинах. Это позволит выявить микроорганизмы, вызывающие указанные заболевания.
• Анальный зуд – в этом случае нужно сдать посев на грибок молочницы, который часто вызывает такой симптом.
• Обследование детей перед поступлением в дошкольное учреждение и школу, поездкой в детский лагерь или санаторий.
• Профосмотр работников, занятых в пищевой промышленности или работающих с продуктами питания.